انواع پرایمرهای زیستی و کاربرد آنها در بیوانفورماتیک
پرایمرها بدون شک مهمترین قسمت از کارکردهای آزمایشگاهی یک زیست شناس می باشد که باید با انواع آن و کاربردشان آشنا شد و به خوبی ویژگی های هرکدام را یاد گرفت تا خطایی در آینده برای توالی ایجاد نشود. در این پست انواع پرایمرهای که پرکاربردترین می باشد معرفی می شود.
پرایمرها نوعی الیگونوکلئوتید هستند که برای تکمیل رشته‌های DNA و RNA استفاده می‌شوند. پرایمرها به دلیل دقت بالا و سرعت بالای واکنش‌های PCR به عنوان یکی از ابزارهای اصلی در تکثیر DNA و در تحقیقات بیولوژی مولکولی و ژنتیک مورد استفاده قرار می‌گیرند. برخی از انواع پرایمرهای زیستی به شرح زیر می‌باشد:
-
پرایمرهای استاندارد: پرایمرهای استاندارد عموماً با طول 18 تا 25 نوکلئوتید هستند و به عنوان پرایمرهای استفاده شده در بیشتر واکنش‌های PCR شناخته می‌شوند.
-
پرایمرهای مخصوص: این پرایمرها معمولاً برای تکثیر DNA یا RNA با بخش‌های خاص مورد استفاده قرار می‌گیرند. به عنوان مثال، پرایمرهای مخصوص می‌توانند برای تشخیص ژن‌های خاص یا ساخت DNA کمپلمانتر مورد استفاده قرار گیرند.
-
پرایمرهای قدرتمند: این پرایمرها برای تکثیر تعداد کمی DNA با طول بلند و یا بخش‌های کمپلکس و چالش برانگیز طراحی شده‌اند.
-
پرایمرهای پانل: این پرایمرها برای تحلیل همزمان چند ژن مختلف در یک نمونه استفاده می‌شوند.
کاربرد پرایمرها در تحقیقات بیولوژی و پزشکی شامل موارد زیر است:
- تشخیص و تعیین نوع باکتری، ویروس، قارچ و سایر میکروارگانیسم‌ها.
- تشخیص بیماری‌های ژنتیکی.
- تعیین ژنوتیپ فرد در یک جمعیت.
انواع پرایمرهای پرکاربرد
1- In silico Primers
ارزیابی پرایمرها قبل از سنتز آنها
پرایمرهای In silico یا پرایمرهای مجازی، پرایمرهایی هستند که به وسیله نرم‌افزارهای خاصی طراحی و شبیه‌سازی می‌شوند. در این روش، به جای طراحی و ساخت پرایمرها به صورت تجربی، از روش‌های تحلیلی مبتنی بر الگوریتم‌های ریاضی برای تعیین پرایمرهای مناسب استفاده می‌شود. به عبارت دیگر، پرایمرهای In silico به صورت رایانه‌ای طراحی و شبیه‌سازی می‌شوند.
استفاده از پرایمرهای In silico به دلیل مزایای بسیار زیادی که دارد، امروزه به عنوان روشی رایج در بسیاری از تحقیقات بیولوژی مولکولی و ژنتیک شناخته شده است. برخی از این مزایا عبارتند از:
-
دقت بالا: پرایمرهای In silico با استفاده از الگوریتم‌های ریاضی و نرم‌افزارهای مخصوص به صورت دقیق و با کیفیت بالا طراحی می‌شوند.
-
سرعت بالا: تهیه پرایمرهای In silico به صورت بسیار سریع انجام می‌شود، به طوری که امکان طراحی پرایمرهای چندگانه در یک زمان وجود دارد.
-
صرفه‌جویی در زمان و هزینه: استفاده از پرایمرهای In silico به دلیل صرفه‌جویی در زمان و هزینه مزیت‌های قابل توجهی دارد.
-
افزایش دقت در طراحی: استفاده از پرایمرهای In silico در تولید پرایمرهای با دقت بالاتر نتیجه می‌دهد، به طوری که احتمال تولید پرایمرهای با خطای بالا کاهش می‌یابد.
2- Standard Primers
تکثیر آمپلیکون مورد نظر بدون هیچ حذف و اضافه ای
تشخیص ویروس و باکتری
پرایمرهای استاندارد (Standard Primers)، نوعی پرایمر هستند که در آزمایشات بیولوژی مولکولی مانند PCR، توالی یابی DNA و کلونینگ به طور رایج استفاده می‌شوند. این پرایمرها توالی‌هایی از نوکلئوتیدها هستند که برای استفاده عمومی بهینه‌سازی شده‌اند و از تامین‌کنندگان تجاری در دسترس هستند.
پرایمرهای استاندارد عموماً برای تقویت یک منطقه مشخص از DNA طراحی می‌شوند و معمولاً 18-25 نوکلئوتید طول دارند. این پرایمرها بر اساس توانایی آنها در انتشار مشخص به دنبال توالی مورد نظر DNA و هدایت سنتز DNA توسط آنزیم پلیمراز DNA انتخاب می‌شوند.
یکی از پرایمرهای استاندارد پرکاربرد، جفت پرایمر فوروارد و ریورس (Forward and Reverse Primers) است که برای تقویت PCR طراحی شده‌اند. این پرایمرها برای فلانک کردن منطقه مورد نظر در توالی DNA و فراهم کردن هدف خاص برای آنزیم پلیمراز برای سنتز رشته‌های جدید DNA استفاده می‌شوند. دیگر انواع پرایمرهای استاندارد شامل پرایمرهای توالی یابی (Sequencing Primers) هستند که برای توالی‌یابی یک منطقه مشخص از DNA طراحی شده‌اند، و پرایمرهای کلونینگ (Cloning Primers) که برای ایجاد سایت‌های آنزیم محدود کننده برای انجام کلونینگ طراحی شده‌اند.
پرایمرهای استاندارد به عنوان یک راه‌حل مناسب و پرهزینه برای بسیاری از آزمایشات بیولوژی مولکولی فراهم می‌آیند
3- Degenerate Primers
شناسایی توالی نوکلئوتیدی ساختارهای کدکننده پروتئین ها و پپتیدها
پرایمرهای Degenerate، نوعی پرایمرهایی هستند که برای تقویت توالی‌های DNA با تنوع ژنتیکی بالا، مانند ژن‌های خانواده‌های ژنتیکی یا بازه‌های وسیعی از ژنوم، طراحی شده‌اند. این پرایمرها شامل ترکیب‌هایی از نوکلئوتیدها هستند که در برخی از جایگاه‌های آنها به جای یک توالی خاص، چندین توالی مختلف قرار می‌گیرند.
در برخی موارد، مشخص نیست که ژن مورد نظر با چه توالی‌ای در جایگاه‌های مشخص شروع و پایان می‌شود. در این حالت، استفاده از پرایمرهای Degenerate، به عنوان یک راه‌حل مناسب برای گسترش توالی مورد نظر می‌تواند موثر باشد. همچنین در برخی موارد، تنوع ژنتیکی بالای جامعه باعث می‌شود که توالی‌های DNA چندگانه برای یک ژن وجود داشته باشد. استفاده از پرایمرهای Degenerate در این حالت نیز می‌تواند به عنوان یک روش برای تقویت PCR و توالی‌یابی این توالی‌های مختلف، مفید باشد.
برای طراحی پرایمرهای Degenerate، معمولاً از یک توالی مشترک با تعدادی جایگاه Degenerate استفاده می‌شود. در این حالت، توالی مشترک توسط یک پرایمر خاص تقویت شده و توالی‌های مختلف با استفاده از پرایمرهای مشابه با ترکیب‌های مختلف از نوکلئوتیدهای Degenerate تقویت می‌شوند.
4- Inverse Primers
شناسایی موقعیت insert ژنومی یا سکانس شناخته شده ای در ژنوم
مطالعه متاژنوم
پرایمرهای Inverse، نوعی پرایمرهایی هستند که برای تشخیص جایگاه‌های قطعه‌های DNA با توجه به توالی‌های پایانی آنها طراحی شده‌اند. این پرایمرها در چند مرحله طراحی می‌شوند. در ابتدا، توالی پایانی مورد نظر در DNA تعیین می‌شود. سپس با استفاده از این توالی، یک پرایمر به طور مستقیم به جایگاه متناظر این توالی طراحی می‌شود. در نهایت، با استفاده از یک پرایمر دیگر که به جایگاه پایانی متناظر با توالی پایانی مورد نظر متصل می‌شود، PCR انجام می‌شود.
استفاده از پرایمرهای Inverse، به عنوان یک روش موثر برای تعیین جایگاه و توالی پایانی قطعات DNA، مفید است. این روش برای تشخیص و شناسایی قطعات DNA مختلف، مانند تعیین نقطه شروع و پایان پروموتورها، نقطه شروع و پایان ژنها و غیره، کاربرد دارد. همچنین، استفاده از پرایمرهای Inverse در برخی موارد به عنوان یک روش برای تشخیص و شناسایی تغییرات جدید در DNA نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد.
در طراحی پرایمرهای Inverse، باید توجه شود که توالی پایانی مورد نظر در DNA باید به شکل دقیق تعیین شده باشد، زیرا اگر این توالی به درستی تعیین نشود، پرایمر مورد نظر به جایگاه اشتباهی متصل می‌شود و انجام PCR با این پرایمر، به نتایج نامطلوب منجر می‌شود.
5- cDNA Primers or RT-Specific Primers
شناسایی ویروس های RNAدار
تعیین مقدار ویروس موجود در بدن موجود زنده
بررسی سطح بیان ژنها
6- Cloning Specific primers
آماده سازی insertهابرای وارد نمودن در وکتور مناسب
7- Linker Primers
تکثیر توالی های شناسایی نشده
آماده سازی توالی های شناسایی نشده برای توالی یابی
8- Assembly Primers
سنتز توالی های طویل DNA
طراحی و تولید بیوسنسورها
9- Asymmetric Primers
توالی یابی
ساخت پروب
آپتامر
10- Multiplex Primers
تکثیر و شناسایی توالی های متعدد با انجام یک واکنش
11- MLPA Primers
تکثیر و شناسایی توالی های متعدد با یک جفت پرایمر با انجام یک یا چند واکنش
12- Nested Primers
تکثیر اختصاصی تر آمپلی کون نسبت به نوع استاندارد
کاهش زمینه نامطلوب تکثیر غیراختصاصی DNA
افزایش مقادیر کم الگو
13- SOEing Primers
اتصال اگزانها به هم و خارج سازی اینترانها
ایجاد ساختارهای کایمریک
14- پرایمرهای ARMS
شناسایی جهش یا بیماری ژنتیکی ناشی از تغییر توالی نوکلئوتیدی
تعیین نوع SNP
15- پرایمرهای ADLP
شناسایی جهش یا بیماری ژنتیکی ناشی از تغییر توالی نوکلئوتیدی
تعیین نوع SNP
16- پرایمرهای Dial-out
بازیابی مولکولهای DNA از کتابخانه DNA
17- پرایمرهای Intersequence
انگشت نگاری DNA
ارزیابی هوموزیگوت بودن یا هترزیگوت بودن
18- پرایمرهای SOEing
اتصال اگزانها به هم و خارج سازی اینترانها
ایجاد ساختارهای کایمریک
19- پرایمرهای BSP
شناسایی پروموترها
تعیین پروموتر بودن یا نبودن یک توالی
20- پرایمرهای MSP
شناسایی پروموترها
تعیین پروموتر بودن یا نبودن یک توالی
21- پرایمرهای Mini
تکثیر نواحی Conserved یا حفاظت شده DNA
22- پرایمرهای Solid
بررسی بیان ژن
23- پرایمرهای Genome Replication
افزایش تعداد نسخه های ژنوم
24- پرایمرهای Plasmid Replication
DSO-Nick
افزایش تعداد نسخه های پلاسمید
