امروز : سه شنبه 16 خرداد 1402
این آموزش در آینده کاملتر خواهد شد.
DNA QC (کنترل کیفیت)فرآیند ارزیابی کمیت، خلوص و سالم بودن DNA ژنومی است. ابتدا، هنگامی که DNA از نمونه بیمار (خون یا باکال) استخراج شد، DNA بررسی می شود تا اطمینان حاصل شود که کاملاً بدون آلودگی پروتئین ها یا حلال های آلی استخراج شده است.
DNA الگو را می توان با دستگاه های اسپکتروسکوپی(اسپکتروفتومتر) تعیین کیفیت و خلوص کرد. جذب نوری در 3 طول موج مختلف شامل 230،260،280 مورد بررسی قرار می گیرد. جذب 260 نانومتر مربوط به DNA می باشد. پس هرچه مقدار DNA بیشتر باشد جذب طول موج در 260 نیز بیشتر می باشد.
زمانیکه مقدار جذب در 260 را بر مقدار جذب بر 280 تقسیم کنیم به عددی بین 1.8 تا 2 میرسیم. اگر کمتر از 1.8 باشد نشان دهنده خلوص DNA می باشد. اگر بیشتر از 1.8 باشد نشان دهنده آلودگی فنولی می باشد. اگر 2 یا بیشتر باشد نشان دهنده وجود آلودگی RNA می باشد.
جذب 280 مربوط به پروتئین های دارای آمینواسیدهای شامل حلقه های آروماتیک می باشد.
اگر جذب نور در طول موج 230 باشد نشان دهنده املاح و عناصر غیر حل شونده است.
همانطور که میدانیم واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR به منظور تکثیر توالی هدف به میزان بسیار زیاد می باشد. برای انجام این واکنش باید اجزاء مختلفی در دسترس باشد تا تمام این واکنش به بهترین صورت ممکن انجام پذیرد. در تصویر فوق شما اجزا و کاربرد هر کدام از اجزا را میبینید. نکات مربوط به این اجزاء PCR بسیار زیاد بوده که سعی می شود به صورت کامل و جدا در هر پست توضیح داده شوند.
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک فناوری ژنتیکی است که برای تکثیر یک بخش خاص از دی‌ان‌ای (DNA) استفاده می‌شود. این تکنیک توسط کری مولیس در سال ۱۹۸۳ کشف شد و به سرعت به یکی از مهم‌ترین ابزارهای تحقیقاتی در زیست‌شناسی مولکولی تبدیل شد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز یا همان Pcr در ابتدا در سال 1983 استفاده شد. از این تکنیک برای تکثیر قطعات مختلف از DNA به میزان قابل توجهی استفاده می شود. در این تکنیک قطعه مورد نظر ما در صورتی که بازدهی 100 درصد باشد در هر سیکل 2 برابر می شود و در انتها به میزان قابل توجهی از قطعه مورد نظر دسترسی پیدا می کنیم. به این نکته باید توجه داشت که در تکنیک پی سی آر ما نیازمند به قطعه ای به نام پرایمر هستیم که باید آن را یا طراحی کرده و یا از مقالات معتبر که قبلا استفاده شده و جواب داده است استفاده کنیم تا در آزمایش به نتایج اشتباه نرسیم.
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک روش بسیار قوی و پرکاربرد در زمینه بیوتکنولوژی و ژنتیک مولکولی است که برای تکثیر یک قطعه DNA خاص به صورت بی‌نهایت در کمتر از چند ساعت استفاده می‌شود. در این روش، تعداد زیادی از تکرارهای واکنش PCR به صورت دو نخی و با استفاده از پرایمرهایی که به سراسر توالی قطعه DNA مورد نظر متصل شده‌اند، باعث تولید کپی‌های بیشتر از قطعه DNA می‌شود. با تکثیر ژن‌ها، تعداد کپی‌های بیشتر از یک ژن تولید می‌شود و امکان تجزیه و تحلیل آن به شیوه‌های مختلف از جمله سیکوئنسینگ، الکتروفورز و تکثیر مولکولی برای بررسی ترکیب ژنتیکی و تشخیص بیماری‌های ژنتیکی فراهم می‌شود.
واکنش PCR شامل چند مرحله است که در آن‌ها از ترکیب سه عنصر اساسی، شامل DNA که قطعه مورد نظر است، پرایمرها و پلیمراز تقویت‌کننده (Taq polymerase) استفاده می‌شود. در مرحله اول، دو رشته DNA به کمک حرارت (در دمای بالا) جدا شده و رشته‌ای از DNA به عنوان الگوی مولکولی برای ساخت کپی استفاده می‌شود. در مرحله دوم، پرایمرها به سمت دو سر رشته DNA می‌رود و با پلیمراز تقویت‌کننده از ترکیب نوکلئوتیدها کپی جدید DNA ساخته می‌شود. در مرحله سوم، فرآیند با تکرار مراحل دوم و سوم تا 30-40 بار ادامه می‌یابد تا تعداد کپی‌های دلخواه از قطعه بدست آید.
ما انواع مختلفی از PCR را داریم اما چیزی که بیشتر از همه برای دانشجویان استفاده می شود پی سی آر معمولی و ریل تایم پی سی آر می باشد.
هر کدام از این دستگاه ها دارای برنامه های مختلفی هستند که با توجه به نوع کار می توان در آن تغییراتی اعمال کرد ( در آینده این موضوع را بررسی می کنیم.)
به طور کلی در پروسه پی سی آر با 3 مرحله روبرو می شویم :
1- مرحله واسرشتی یا Denaturation که دمای 90-95 درجه به مدت 2-10 دقیقه به منظور جدا شدن 2 رشته DNA که با پیوند هیدروژنی به هم متصل هستند اعمال می گردد.
2- مرحله Annealing یا اتصال پرایمر که بسته به طراحی پرایمر این مرحله می تواند در دمای خاصی اعمال شود.
3- مرحله طویل سازی یا Extension که دما افزایش یافته تا آنزیم پلیمراز عمل کند.
نکته : زمان دهی به هر مرحله می تواند متفاوت باشد.
نکته 2 : تعداد سیکل ها با توجه به نوع استخراج و همچنین طراحی پرایمر شما می تواند کم یا زیاد شود.
در پست بعدی به بررسی اجزا این تکنیک می پردازیم.