واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک فناوری ژنتیکی است که برای تکثیر یک بخش خاص از دی‌ان‌ای (DNA) استفاده می‌شود. این تکنیک توسط کری مولیس در سال ۱۹۸۳ کشف شد و به سرعت به یکی از مهم‌ترین ابزارهای تحقیقاتی در زیست‌شناسی مولکولی تبدیل شد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز یا همان Pcr در ابتدا در سال 1983 استفاده شد. از این تکنیک برای تکثیر قطعات مختلف از DNA به میزان قابل توجهی استفاده می شود. در این تکنیک قطعه مورد نظر ما در صورتی که بازدهی 100 درصد باشد در هر سیکل 2 برابر می شود و در انتها به میزان قابل توجهی از قطعه مورد نظر دسترسی پیدا می کنیم. به این نکته باید توجه داشت که در تکنیک پی سی آر ما نیازمند به قطعه ای به نام پرایمر هستیم که باید آن را یا طراحی کرده و یا از مقالات معتبر که قبلا استفاده شده و جواب داده است استفاده کنیم تا در آزمایش به نتایج اشتباه نرسیم.
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک روش بسیار قوی و پرکاربرد در زمینه بیوتکنولوژی و ژنتیک مولکولی است که برای تکثیر یک قطعه DNA خاص به صورت بی‌نهایت در کمتر از چند ساعت استفاده می‌شود. در این روش، تعداد زیادی از تکرارهای واکنش PCR به صورت دو نخی و با استفاده از پرایمرهایی که به سراسر توالی قطعه DNA مورد نظر متصل شده‌اند، باعث تولید کپی‌های بیشتر از قطعه DNA می‌شود. با تکثیر ژن‌ها، تعداد کپی‌های بیشتر از یک ژن تولید می‌شود و امکان تجزیه و تحلیل آن به شیوه‌های مختلف از جمله سیکوئنسینگ، الکتروفورز و تکثیر مولکولی برای بررسی ترکیب ژنتیکی و تشخیص بیماری‌های ژنتیکی فراهم می‌شود.
واکنش PCR شامل چند مرحله است که در آن‌ها از ترکیب سه عنصر اساسی، شامل DNA که قطعه مورد نظر است، پرایمرها و پلیمراز تقویت‌کننده (Taq polymerase) استفاده می‌شود. در مرحله اول، دو رشته DNA به کمک حرارت (در دمای بالا) جدا شده و رشته‌ای از DNA به عنوان الگوی مولکولی برای ساخت کپی استفاده می‌شود. در مرحله دوم، پرایمرها به سمت دو سر رشته DNA می‌رود و با پلیمراز تقویت‌کننده از ترکیب نوکلئوتیدها کپی جدید DNA ساخته می‌شود. در مرحله سوم، فرآیند با تکرار مراحل دوم و سوم تا 30-40 بار ادامه می‌یابد تا تعداد کپی‌های دلخواه از قطعه بدست آید.
ما انواع مختلفی از PCR را داریم اما چیزی که بیشتر از همه برای دانشجویان استفاده می شود پی سی آر معمولی و ریل تایم پی سی آر می باشد.
هر کدام از این دستگاه ها دارای برنامه های مختلفی هستند که با توجه به نوع کار می توان در آن تغییراتی اعمال کرد ( در آینده این موضوع را بررسی می کنیم.)
به طور کلی در پروسه پی سی آر با 3 مرحله روبرو می شویم :
1- مرحله واسرشتی یا Denaturation که دمای 90-95 درجه به مدت 2-10 دقیقه به منظور جدا شدن 2 رشته DNA که با پیوند هیدروژنی به هم متصل هستند اعمال می گردد.
2- مرحله Annealing یا اتصال پرایمر که بسته به طراحی پرایمر این مرحله می تواند در دمای خاصی اعمال شود.
3- مرحله طویل سازی یا Extension که دما افزایش یافته تا آنزیم پلیمراز عمل کند.
نکته : زمان دهی به هر مرحله می تواند متفاوت باشد.
نکته 2 : تعداد سیکل ها با توجه به نوع استخراج و همچنین طراحی پرایمر شما می تواند کم یا زیاد شود.
در پست بعدی به بررسی اجزا این تکنیک می پردازیم.
نرم افزارهای برتر طراحی پرایمر برای واکنش های PCR
مکانیسم PCR
واکنش PCR شامل سه مرحله اصلی است:
- دناتوراسیون: در این مرحله، DNA الگو با گرم شدن به دو رشته تک‌رشته‌ای جدا می‌شود.
- وصل شدن پرایمرها: در این مرحله، پرایمرها به انتهای رشته‌های تک‌رشته‌ای DNA متصل می‌شوند. پرایمرها رشته‌های کوتاهی از DNA هستند که به طور مصنوعی ساخته می‌شوند و به طور مکمل به توالی DNA هدف متصل می‌شوند.
- پلیمریزاسیون: در این مرحله، DNA پلیمراز از نوکلئوتیدها برای ساخت رشته‌های جدید DNA استفاده می‌کند. DNA پلیمراز یک آنزیم است که DNA را سنتز می‌کند.
این سه مرحله به صورت تکراری انجام می‌شوند، که باعث می‌شود تعداد نسخه‌های DNA هدف به صورت نمایی افزایش یابد.
اجزای PCR
واکنش PCR شامل اجزای زیر است:
- DNA الگو: DNA هدفی است که باید تکثیر شود.
- پرایمرها: رشته‌های کوتاهی از DNA که به طور مکمل به توالی DNA هدف متصل می‌شوند.
- DNA پلیمراز: آنزیمی که DNA را سنتز می‌کند.
- نیوکلئوتیدها: بلوک‌های سازنده DNA.
- بافر PCR: یک محلول که pH و سایر شرایط واکنش را تنظیم می‌کند.
- **ماده افزودنی: مواد افزودنی دیگری که ممکن است برای بهبود کارایی واکنش PCR استفاده شوند.
کاربردهای PCR
واکنش PCR در طیف گسترده‌ای از کاربردها در زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود، از جمله:
- تشخیص بیماری‌ها: PCR برای تشخیص بیماری‌های ژنتیکی، عفونی و سرطانی استفاده می‌شود.
- شناسایی ژن‌ها: PCR برای شناسایی و توالی‌یابی ژن‌ها استفاده می‌شود.
- توالی‌یابی DNA: PCR برای توالی‌یابی DNA استفاده می‌شود.
- دستکاری DNA: PCR برای دستکاری DNA، مانند تکثیر ژن‌ها یا اصلاح جهش‌ها استفاده می‌شود.
مزایا و معایب PCR
واکنش PCR مزایای زیادی دارد، از جمله:
- حساسیت بالا: PCR می‌تواند حتی مقادیر بسیار کوچکی از DNA را تشخیص دهد.
- سرعت بالا: PCR می‌تواند DNA را در عرض چند ساعت تکثیر کند.
- تطبیق‌پذیری بالا: PCR می‌تواند برای تکثیر DNA از انواع مختلف منابع استفاده شود.
با این حال، PCR همچنین دارای برخی معایب است، از جمله:
- هزینه بالا: تجهیزات و مواد مورد نیاز برای PCR می‌تواند گران باشد.
- خطر آلودگی: PCR می‌تواند منجر به آلودگی DNA شود.
- مصرف انرژی بالا: PCR می‌تواند انرژی زیادی مصرف کند.
PCR در طیف گسترده ای از کاربردهای زیست شناسی مولکولی استفاده می شود، از جمله:
- تشخیص بیماری ها
- تعیین توالی DNA
- مهندسی ژنتیک
- تحقیقات علمی
برای انجام موفقیت آمیز PCR، چندین نکته مهم باید در نظر گرفته شود:
- کیفیت DNA الگو: DNA الگو باید با کیفیت بالا باشد تا واکنش PCR به درستی انجام شود.
- طول پرایمرها: طول پرایمرها باید بین 18 تا 25 نوکلئوتید باشد. پرایمرهای کوتاهتر ممکن است به درستی به توالی DNA هدف متصل نشوند، در حالی که پرایمرهای بلندتر ممکن است منجر به واکنش PCR کمتر کارآمد شوند.
- دمای اتصال پرایمرها: دمای اتصال پرایمرها باید به گونه ای تنظیم شود که پرایمرها در دمای مناسب به توالی DNA هدف متصل شوند.
- غلظت DNA پلیمراز: غلظت DNA پلیمراز باید به گونه ای تنظیم شود که واکنش PCR به درستی انجام شود.
نتیجه‌گیری
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک قدرتمند است که برای تکثیر DNA در آزمایشگاه استفاده می‌شود. این تکنیک به طور گسترده‌ای در زیست شناسی مولکولی برای اهدافی مانند تشخیص بیماری‌ها، شناسایی ژن‌ها و توالی‌یابی DNA استفاده می‌شود.
